CRISPR を使用したヒトノロウイルス遺伝子型 GII.4 または GII.17 の超高感度かつ視覚的検出

Virology Journal volume 19、記事番号: 150 (2022) この記事を引用

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メトリクスの詳細

CRISPR-Cas12a センサーと等温信号増幅の統合は、ヒト​​の病原体を診断するための低コストで使い捨ての超高感度アッセイを開発するために利用できます。

ノロウイルス (NOV) 遺伝子型 GII.4 または GII.17 を直接検出するための、RT-RAA-Cas12a を介したリアルタイムまたはエンドポイント蛍光およびラテラル フロー ストリップ (LFS) アッセイを検討しました。

結果は、我々のRT-RAA-Cas12a媒介蛍光アッセイおよびLFSアッセイが、ウイルスタンパク質1遺伝子を標的とすることによってNOV GII.4またはGII.17を検出できることを示した。 弊社の RT-RAA-Cas12a 媒介蛍光アッセイおよび LFS アッセイは、他の関連ウイルスとの交差反応を起こすことなく、NOV GII.4 または GII.17 を特異的に検出できます。 検出下限は約 30 ～ 40 分以内に 0.1 コピー/μL に達する可能性があり、結果は紫外光照射装置または複雑な機器を使用せずに LFS を使用して視覚化されました。 さらに、当社の RT-RAA-Cas12a 媒介蛍光および LFS アッセイは、95.7% および 94.3% の陽性予測一致、および 100％ の陰性予測一致により、リアルタイム RT-PCR アッセイに代わる視覚的で高速な代替手段を提供しました。

我々の RT-RAA-Cas12a 媒介アプローチを組み合わせると、リソースが限られた環境での NOV GII.4 および/または GII.17 のポイントオブケア診断に大きな可能性を秘めています。

ヒトノロウイルス (NOV) は現在、すべての非細菌性胃腸炎の大部分の主な原因として認識されています [1]。 NOV は、健康な子供と成人の両方に、通常 48 時間続く急性の嘔吐や下痢などの症状を引き起こす可能性がある RNA ウイルスのグループです。 NOV は、少数の粒子でも病気を引き起こす可能性があるため感染力が高く、感染者は大量のウイルスを放出します [2、3]。 NOV は主に、NOV に感染したヒトの糞便との直接的または間接的な接触による汚染された食品や水への曝露 [4]、または感染者の嘔吐によって生成されるエアロゾル内での感染によりヒトに伝播します [5]。 NOV の高い感染力と効率的な伝播能力の結果、病院や介護施設を含む閉鎖的な地域環境での NOV の発生が世界的に報告されており、攻撃的な感染を減らすための介入措置が必要です [6]。

ヒトノロウイルスは、10 の異なる遺伝子グループ (GI-GX) と少なくとも 48 の同定された遺伝子型を持つ膨大な遺伝的多様性を保持しています [7]。 NOV の遺伝子グループ GI、GII、および GIV はヒトの感染に関連していることが知られています。 NOV GII の約 21 の遺伝子型のうち、遺伝子型 GII.4 は、過去 10 年間における NOV の画期的感染の臨床症例の大部分の原因となっています [8]。 最近、NOV の GII.17 の新しい遺伝子型が出現し、アジアの一部の地域で急速に蔓延し、NOV の優勢株となり、さらなる流行の脅威のリスクをもたらしています [9]。 これまで、ヒトにおける効果的な抗ウイルス治療に関する報告はわずか数件しかない [10] ことを除けば、現在、ヒト用に認可された利用可能な NOV ワクチンは存在しません [11]。 その結果、NOV 感染のより迅速かつ早期の検出は、早期介入、治療、感染予防を促進する上で重要な役割を果たし、ひいては感染性ウイルスの伝播リスクを軽減する可能性があります。

NOV を検出するための現在のゴールドスタンダードは、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (RT-PCR)、ネステッド RT-PCR、リアルタイム RT-PCR などの分子技術です [12]。 これらの方法の中でも、リアルタイム RT-PCR は感度と特異性が高く、キャリーオーバー汚染のリスクが低いため、NoV 感染の検出または診断に広く使用されています。 現在、市販されているさまざまなリアルタイム RT-PCR アッセイは、NoV GI では 10 ～ 50 ゲノム コピー/反応、NoV GII では 1 ～ 300 ゲノム コピー/反応でのリアルタイム RT-PCR の感度を実証しています [13]。 しかし、リアルタイム RT-PCR 法は通常、高度な機器と高度なスキルを持つ人材に依存しており、平均反応時間は約 2 時間であり、そのすべてが単純、迅速、およびポイントオブケア (POC) には適していません。 ) 日常的な検出のための資源が限られた地域での NOV 感染を診断するための分子アッセイ。 最近の研究では、Sun ら。 は、NOV の GII.4 および GII.17 遺伝子型を検出および区別するための紙ベースの比色法を発表しました [14]。 しかし、この方法による検査は比較的長い時間（約 3 時間）を必要とし、検出範囲は 2.6 fM ～ 0.5 pM に限定されるため、RT-PCR と比較して感度が低くなります [14]。 逆に、規則的に間隔をあけられた短いパリンドロームリピート (CRISPR) とその CRISPR 関連 (Cas) ヌクレアーゼから構成される RNA ガイドクラスターヌクレアーゼベースの核酸検出システムは、優れた迅速性、感度、特異性により、最近、感染性病原体に対する次世代 POC 分子診断を活用する [15、16、17]。 現在、Cas12a、Cas12b、Cas13a、および Cas14 を含むいくつかのバージョンの Cas ヌクレアーゼの有効性が、in vitro および in vivo アッセイの両方で評価されています [18、19、20、21]。 これらのヌクレアーゼのうち、Cas12a (以前は Cpf1) はクラス II V エンドヌクレアーゼです。 RuvC ヌクレアーゼ ドメインを含む Cas12a は、T-rich プロトスペーサー隣接モチーフ (PAM) 配列を含む単一の CRISPR RNA (crRNA) によって誘導され、特定の部位で二本鎖 DNA (dsDNA) を切断するか、PAM を使用せずに非特異的 ssDNA 切断を実行します。トランスインビトロで[18]。 さらに、Cas12a ヌクレアーゼとリコンビナーゼポリメラーゼ増幅 (RPA) または逆転写 RPA (RT-RPA) の組み合わせは、DNA エンドヌクレアーゼ標的 CRISPR トランス レポーター (DETECTR) システムを開発するために徹底的に研究されており、核酸検出の感度と特異性が大幅に向上します。 18]。