クライオの自動ガラス化

Nature Communications volume 13、記事番号: 2985 (2022) この記事を引用

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13 オルトメトリック

メトリクスの詳細

クライオ電子顕微鏡法におけるデータ収集と画像処理の速度と効率は、過去 10 年間で向上しました。 しかし、凍結標本調製技術は遅れており、より高速で再現性の高い標本調製装置が必要とされています。 ここでは、限られたユーザー操作のみを必要とする、高度に自動化されたサンプル処理を備えたガラス化装置を紹介します。 さらに、この装置では、余分な液体が吸い取り紙ではなくチューブによる吸引によって除去されるため、光学顕微鏡を使用した薄膜の検査が可能になります。 露点制御と組み合わせることで、制御された再現可能な方法での薄膜作製が可能になります。 利点は、電子顕微鏡データを取得する前に、準備された低温試料の品質が特徴付けられることです。 このデバイスの実用性と性能は、タンパク質懸濁液、脂質小胞、細菌細胞およびヒト細胞のガラス化によって得られた実験結果を用いて説明され、その後、単粒子分析、低温電子断層撮影法、および低温相関光学顕微鏡および電子顕微鏡を使用して画像化されます。

生体サンプルの急速凍結による硝子体水（非晶質氷）への低温固定は、タンパク質懸濁液、ウイルス、細菌、真核細胞などの生体サンプルの構造をほぼ完璧に保存できます。 凍結固定には、氷 (結晶) の形成が防止されるように、十分に高い凍結速度 (>100,000 °C/秒) が必要です。 その結果、水はガラスのような非晶質の準安定な過渡状態になります1。 ガラス化を使用すると、タンパク質と細胞の構造を元の水和環境で原子分解能まで保存できます。 ガラス化サンプルは、クライオ電子顕微鏡 (cryo-EM) に必要な真空条件に適合しており、光学式クライオ蛍光光学顕微鏡 (cryofLM)2 で研究することもできます。 相関光電子顕微鏡法 (CLEM)3 は、EM の利点 (高解像度、構造コンテキスト) と、利用可能な幅広い光学顕微鏡技術の利点 (ライブ イメージング、多用途の標識) を組み合わせたものです 4,5。

液体エタン、または極低温としてエタン/プロパン混合物を使用したプランジ凍結によるガラス化は、厚さ 10 ミクロンまでの生体サンプルの冷凍調製に実用的なアプローチであることが示されています 1,7。 クライオ EM の場合、精製されたタンパク質とウイルスの懸濁液は数十ナノメートルの薄い水層に保存され、そこから SPA8,9 を使用して原子分解能の再構成を決定できます。 細菌や厚さ数ミクロンまでの付着細胞などのより大きな構造もガラス化に適しています。 分子分解能を備えた三次元再構成は、厚さ約 0.5 ミクロンまでのサンプルのクライオ電子断層撮影法 (cryo-ET) を使用して決定できます 10,11。 液体層の厚さを最小限に抑えることが重要です。これは、サンプルの周囲の媒体が電子を散乱させ、画像の背景ノイズが増加し、それによって画像の信号対雑音比が低下し、結果として得られる 3 次元再構成で達成できる解像度が低下するためです。

EM 用の電子顕微鏡標本サポート (通常、直径 3.05 mm の銅グリッドでサポートされた穴の開いたカーボン層) 上に薄い液体サンプル層を生成するという重要なステップには問題があります。なぜなら、薄い水の層は本質的に不安定であり、液体サンプルの層を正確に制御する必要があるためです。水の層の厚さが難しい。 空気中またはアルキルアミン 12,13 中でのグロー放電によって支持フィルムを親水性にすると、支持フィルム上に薄い液体層が形成され、湿気の飽和した環境が薄層の安定化に役立つことがわかりました。 現在の一般的な手法は、数マイクロリットルの検体溶液をグロー放電した支持フィルムに塗布し、続いて濾紙を使用して余分な液体を吸い取り、その後プランジ凍結することです14,15。